雙光子顯微成像用飛秒激光器
雙光子激發(fā)熒光(TPEF)顯微鏡,也稱為雙光子顯微鏡,是對(duì)活體組織深層三維成像的方法。深度成像是TPEF顯微鏡固有的優(yōu)勢(shì),它使用了更長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)(通常是近紅外波段),因而其帶來(lái)的散射比傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡中所使用的較短的可見(jiàn)波長(zhǎng)更少。更長(zhǎng)的波長(zhǎng)同時(shí)也減少了來(lái)自散射光的背景照明,并增加了在更高深度處的對(duì)比度。目前,用TPEF顯微鏡可以獲得1mm深度的體內(nèi)大腦圖像。
在熒光顯微鏡中,當(dāng)兩個(gè)獨(dú)立的光子被一種介質(zhì)同時(shí)吸收時(shí),就會(huì)發(fā)生雙光子激發(fā)。這需要兩個(gè)合適能量的光子在這樣的介質(zhì)上時(shí)間和空間上同時(shí)重合;通常來(lái)說(shuō)這不需要非常大的激發(fā)光子通量,當(dāng)然光子通量越大, 雙光子同時(shí)被吸收的概率就越大。在TPEF顯微鏡中,更高的光子通量會(huì)帶來(lái)更高的效率,從而帶來(lái)圖像質(zhì)量和分辨率的提升。
在TPEF顯微鏡中,雙光子激發(fā)所需的大光子通量更多的是通過(guò)寬波段可調(diào)諧的鈦寶石飛秒激光器實(shí)現(xiàn)的,激光器典型規(guī)格脈寬為100fs,重復(fù)頻率約為80MHz,這可以給雙光子顯微鏡帶來(lái)非常高的峰值功率和大光子通量。然而,激光器較高的平均功率(在1~4瓦范圍內(nèi))會(huì)由于激發(fā)波長(zhǎng)的線性吸收引起的與介質(zhì)的光熱相互作用而造成熱損傷。這種效應(yīng)在體內(nèi)成像中尤其重要,因?yàn)闇囟瘸^(guò)40oC會(huì)導(dǎo)致不可逆的損傷。因此,傳統(tǒng)的固態(tài)激光器所提供的平均功率必須被衰減才能實(shí)際應(yīng)用于TPEF顯微鏡,峰值功率也會(huì)相應(yīng)地降低。保持較低的平均功率以避免熱損傷,同時(shí)縮短脈沖持續(xù)時(shí)間是一種替代的提高峰值功率的方法。這減少了光子落在介質(zhì)上的時(shí)間間隔,同時(shí)提高了介質(zhì)被吸收的概率。
近日,西班牙FYLA公司利用先進(jìn)超連續(xù)譜全光纖激光器技術(shù)得到脈沖寬度短至15fs的商業(yè)激光器,命名型號(hào)“SCH"。與傳統(tǒng)的100fs激光器相比,SCH的15fs脈沖寬度可在相同平均功率水平下提供超過(guò)傳統(tǒng)飛秒激光器7倍的光子通量。
圖1:FCH 寬光譜光纖飛秒激光器,波長(zhǎng)范圍950-115nm,脈沖寬度15fs, 峰值功率>200kW
圖2:藍(lán)色線:SCH 飛秒激光器光譜曲線;橙色線:1um波段百秒激光器光譜曲線;灰色線:紅色熒光蛋白DsRed吸收截面光譜
但是,巨幅提高每個(gè)時(shí)間和面積上可用光子數(shù)量對(duì)圖像的真正影響是什么呢?
一、更高的激發(fā)效率,更高的圖像亮度
理論上,在雙光子顯微鏡中,圖像的亮度與激發(fā)效率直接相關(guān),而激發(fā)效率*依賴于光子通量和熒光團(tuán)的二階非線性激發(fā)截面(GM) 。作為一個(gè)例子,我們可以嘗試計(jì)算熒光蛋白mRFP在15fs激光脈寬(如SCH飛秒激光器)和1050nm中波長(zhǎng)照射下的激發(fā)效率。與100fs的激光器相比,15fs激光器具有更寬的帶寬(達(dá)200nm),可以在900到1200nm之間激發(fā)mRFP,與100fs激光器的11nm相比,這是一個(gè)更寬的光譜區(qū)域。
圖3:藍(lán)色曲線:以1050nm為中心的SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率; 橙色曲線:以1050nm為中心的100fs光纖飛秒激光器的峰值功率;黑色曲線:mRFP的二階非線性激勵(lì)截面(GM)
考慮到各波長(zhǎng)的峰值功率和激發(fā)截面,可以計(jì)算出mRFP的激發(fā)效率。結(jié)果表明,與傳統(tǒng)100fs激光器相比較,SCH飛秒激光器15fs的脈沖寬度使得激發(fā)效率提高了50%。
圖4:藍(lán)色曲線:SCH 15fs全光纖飛秒光纖激光器的峰值功率; 橙色曲線:100fs光纖飛秒激光器的峰值功率;黑色曲線:mRFP的二階非線性激勵(lì)截面(GM)
圖5:小鼠腸道切片的2P熒光顯微鏡圖像,用SYTOX Green標(biāo)記細(xì)胞核(黃色)和Alexa Fluor 568煥鈦標(biāo)記肌動(dòng)蛋白絲(藍(lán)色)
二、多色同時(shí)激發(fā)
想象一下,同時(shí)成像多個(gè)波段范圍的熒光團(tuán),而不必考慮選擇最佳激發(fā)波長(zhǎng)的激光器。在雙光子顯微鏡中,使用傳統(tǒng)的100fs激發(fā)激光器,這通常是一個(gè)復(fù)雜的,有時(shí)甚至是不可能完成的任務(wù)。傅里葉變換極限的100fs近紅外固體飛秒激光器(例如鈦寶石飛秒激光器、920nm光纖飛秒激光器)的光譜寬度通常在10~20nm范圍內(nèi),它們只能同時(shí)激發(fā)激發(fā)光譜在10~20nm光譜范圍內(nèi)的熒光團(tuán)。因此,若想用單臺(tái)激光器去同時(shí)激發(fā)更多種類的熒光團(tuán)就需要帶寬更寬,脈沖更短的激光器。
SCH寬光譜飛秒激光器在提供15fs脈沖寬度的同時(shí)以1050nm為中心波長(zhǎng)提供200nm的帶寬,在這個(gè)帶寬范圍內(nèi) (橫跨900到1200nm)的所有綠色和紅色的熒光團(tuán)都可以同時(shí)被這種激光器激發(fā)。這對(duì)于雙光子顯微鏡來(lái)說(shuō),同時(shí)對(duì)多個(gè)熒光團(tuán)成像成為一個(gè)可行的,實(shí)用的和簡(jiǎn)單的替代。
圖5:常見(jiàn)熒光探針激發(fā)波長(zhǎng)
圖6:小鼠腸道的雙光子熒光顯微鏡圖像
用Sytox Green標(biāo)記細(xì)胞核(洋紅色),F(xiàn)ITC濾波器;用Alexa Fluor 568 Phaloidin標(biāo)記肌動(dòng)蛋白絲(綠色),TRITC過(guò)濾器。兩種熒光標(biāo)記物同時(shí)被SCH激光器激發(fā),用尼康的熒光濾片組過(guò)濾熒光。
Image taken at ICFO-SLN the Super-Resolution Light Microscopy at ICFO- Institute of Photonics Sciences, Barcelona, Spain.
綜上所述,F(xiàn)YLA公司推出的新型、緊湊而強(qiáng)大的SCH全光纖飛秒激光器激光器,提供15fs的脈沖持續(xù)時(shí)間和高峰值功率(>200kW),為體內(nèi)樣本的低光損傷激發(fā)提供了強(qiáng)大的工具。結(jié)合全光纖激光器的緊湊性和堅(jiān)固性性,SCH飛秒激光器成為雙光子顯微鏡的特殊激光選擇。
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