科普-超分辨顯微成像之多波長合束激光器

曾經(jīng)有這樣一個傳言，“中國的*長城是太空中能看到的地球上的人工建筑”，這讓我們中國人自豪無比。但神舟載人飛船上天后，包括楊利偉、劉洋在內(nèi)的眾多航天員都曾說過，“沒有看到長城”，這是為何呢？

長城

其實(shí)人眼的分辨率很有限，只有0.3角分左右，即便在二百公里左右的近地點(diǎn)軌道高度上，不考慮任何天氣因素，人眼至多看清17米以上的目標(biāo)，因此對于寬度不過七八米的長城，確實(shí)有心無力了。當(dāng)然了，若是不考慮“看清”，而只是“看到”，那么只要在夜間將長城照的燈火通明，太空中的宇航員就有可能“看到”長城了。不過這就像遠(yuǎn)遠(yuǎn)看到商店的霓虹燈箱，卻看不清楚燈箱的字一樣，不屬于我們此處討論的范疇。

200公里左右太空看長城效果示意圖

成像系統(tǒng)的分辨率之所以會受到限制，除了光學(xué)元件存在像差之外，更重要的原因是光波存在衍射效應(yīng)，使得一個理想無限小的點(diǎn)物體發(fā)射的光波通過系統(tǒng)成像后，由于成像系統(tǒng)口徑有限，物體光的高頻成分被阻擋，終參與成像的只有物體光波的低頻成分（因此傳統(tǒng)成像系統(tǒng)本質(zhì)上相當(dāng)于一個低通濾波器），使得終的像不再是一個無限小的理想點(diǎn)，而成為了一個彌散的亮斑，稱為“艾里斑”。
 

因此當(dāng)兩個點(diǎn)物體距離較近時，它們通過成像系統(tǒng)后形成的兩個艾里斑就會重疊到一起無法分辨，兩個物點(diǎn)恰能分辨的距離就是極限分辨距離，對應(yīng)的張角即為極限分辨角，這就是的“瑞利判據(jù)”?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，通常情況下該極限分辨率與光的波長（λ）、成像系統(tǒng)口徑（D）和數(shù)值孔徑（NA）等參數(shù)有關(guān)。

瑞利判據(jù)

為了獲得更好的成像效果，科學(xué)家嘗試了許許多多的方法：在光刻系統(tǒng)中使用越來越短的光波（如目前因特爾等芯片企業(yè)已開始使用極紫外光），擴(kuò)大成像系統(tǒng)口徑（如天文望遠(yuǎn)鏡口徑已達(dá)到10米以上），增加成像系統(tǒng)數(shù)值孔徑（如顯微成像系統(tǒng)使用浸油等方式獲得更大的NA）等，但這些方法都未能擺脫理論極限的影響。
 

“衍射極限”仿佛是一片籠罩在頭頂?shù)年庼?，成為了看似?jiān)不可摧的障礙。為了能夠打破這個枷鎖和桎梏，實(shí)現(xiàn)超分辨成像，科學(xué)家們真是腦洞大開，展現(xiàn)出了無窮的智慧。

讓我們看看科學(xué)家們通過哪些方法打破桎梏：
結(jié)構(gòu)光照明顯微(SIM)
普通光學(xué)顯微鏡的成像過程可以通過點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)進(jìn)行描述，通過對點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)進(jìn)行傅里葉變換，可獲得顯微系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)。由于衍射極限的存在，光學(xué)傳遞函數(shù)限制了通過顯微系統(tǒng)的信息量，只允許低頻信息通過系統(tǒng)，濾除代表細(xì)節(jié)的高頻信息，即限制了系統(tǒng)的分辨率。
 

結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡實(shí)現(xiàn)超分辨的原理，就是利用特定結(jié)構(gòu)的照明光 在成像過程把位于光學(xué)傳遞函數(shù)范圍外的一部分信息轉(zhuǎn)移到范圍內(nèi)，利用特定算法將范圍內(nèi)的高頻信息移動到原始位置，從而擴(kuò)展通過顯微系統(tǒng)的樣品頻域信息，使得重構(gòu)圖像的分辨率超越衍射極限的限制。
 

對于光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)，光學(xué)傳遞函數(shù)的三維結(jié)構(gòu)是圓環(huán)結(jié)構(gòu)，在零頻位置存在凹陷。凹陷帶來的后果就是CCD 上記錄的信息不僅包含物鏡焦平面上的樣品信息，同時包含焦平面外的樣品信息。由于受到焦平面外的信息的干擾，常規(guī)熒光顯微鏡無法獲得層析圖像。三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡提高分辨率、獲得層析圖像的原理，就是利用特定結(jié)構(gòu)的照明光來獲得樣品的高頻信息，采用特定算法在橫向和縱向上擴(kuò)展樣品頻域信息的同時彌補(bǔ)凹陷帶來的影響。

飽和結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(SSIM)的原理

法國OXXIUS多波長合束激光器應(yīng)用在Nikon顯微鏡

受激發(fā)射損耗顯微（STED）

在STED顯微術(shù)中，有效熒光發(fā)光面積的減小是通過受激發(fā)射效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。一個典型的STED顯微系統(tǒng)中需要兩束照明光，其中一束為激發(fā)光，另外一束為損耗光。當(dāng)激發(fā)光的照射使得其衍射斑范圍內(nèi)的熒光分子被激發(fā)，其中的 電子躍遷到激發(fā)態(tài)后，損耗光使得部分處于激發(fā)光斑外圍的電子以受激發(fā)射的方式回到基態(tài)，其余位于激發(fā)光斑中心的被激發(fā)電子則不受損耗光的影響，繼續(xù)以自發(fā)熒光的方式回到基態(tài)。

由于在受激發(fā)射過程中所發(fā)出的熒光和自發(fā)熒光的波長及傳播方向均不同，因此真正被探測器所接受到的光子均是由位于激發(fā)光斑中心部分的熒光樣品通過自發(fā)熒光方式產(chǎn)生的。由此，有效熒光的發(fā)光面積得以減小，從而提高了系統(tǒng)的分辨率。STED顯微術(shù)能實(shí)現(xiàn)超分辨的另一個關(guān)鍵在于受激發(fā)射與自發(fā)熒光相互競爭中的非線性效應(yīng)。

當(dāng)損耗光照射在激發(fā)光斑的邊緣位置使得該處樣品中的電子發(fā)生受激發(fā)射作用時，部分電子不可避免地仍然會以自發(fā)熒光的方式回到基態(tài)。然而當(dāng)損耗光的強(qiáng)度超過某一閾值之后，受激發(fā)射過程將出現(xiàn)飽和，此時以受激發(fā)射方式回到基態(tài)的電子將占絕大多數(shù)，而以自發(fā)熒光方式回到基態(tài)的電子則可以忽略不計(jì)。因此，通過增大損耗光的強(qiáng)度，使得激發(fā)光斑范圍內(nèi)更多范圍的自發(fā)熒光被抑制，可以提高STED顯微術(shù)的分辨率。

受激發(fā)射損耗(STED)顯微的原理

法國OXXIUS公司多波長合束激光器

STORM和PALM超分辨顯微成像技術(shù)

STORM技術(shù)中，使用Cy3和Cy5分子對作為熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)超分辨成像，因?yàn)椴煌ㄩL光可以控制Cy5在熒光激發(fā)態(tài)和暗態(tài)之間切換，例如紅色633nm激光可以激活Cy5發(fā)射熒光，同時長時間照射可以將Cy5分子轉(zhuǎn)換成暗態(tài)不發(fā)光。之后用綠色的532nm激光照射Cy5分子時，可以將其從暗態(tài)轉(zhuǎn)換成熒光態(tài)，而此過程的長短依賴于第二個熒光分子Cy3和Cy5之間的距離，因此，當(dāng)Cy3和Cy5交聯(lián)成分子對時，具備了特定的激發(fā)光轉(zhuǎn)換熒光分子發(fā)射波長的特性。

在顯微觀察前，首先將待測觀察樣品用染劑染色，將Cy3和Cy5分子對膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來標(biāo)記細(xì)胞的內(nèi)源蛋白，然后用波長為633nm的紅光長時間照射樣品使Cy5發(fā)射熒光后全部轉(zhuǎn)化為暗態(tài)，采用波長為532nm的綠光激發(fā)Cy3，從而使Cy5處于熒光態(tài)。激發(fā)過程中應(yīng)使532nm綠光強(qiáng)度足夠低，以保證在衍射極限范圍內(nèi)至多只有一個Cy5熒光分子被激活至熒光態(tài)。而后，用波長為633nm的紅色激光照射待觀察樣品，使處于熒光態(tài)的Cy5分子發(fā)射熒光。通過電子相機(jī)讀取熒光圖像，采用函數(shù)擬合的方法對圖像進(jìn)行處理，進(jìn)而確定每個熒光點(diǎn)的中心位置。經(jīng)過足夠多次數(shù)循環(huán)后對獲得的熒光點(diǎn)位置進(jìn)行疊加，終得到超分辨顯微圖像。

STORM技術(shù)中熒光開關(guān)原理圖

PALM技術(shù)中，使用GFP突變體作為光活化蛋白（PA-GFP）來標(biāo)記靶蛋白，并在細(xì)胞中表達(dá)。用405nm激光器低能量照射細(xì)胞表面，一次僅激活出稀疏分布的幾個熒光分子，然后用561nm激光激發(fā)得到熒光，通過高斯擬合來定位這些熒光分子，在確定這些分子的位置后，長時間使用561nm激光來漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光分子后，使他們不能夠被下一輪的激光再激活出來。

再分別用405nm和561nm激光來激活、激發(fā)和漂白其他熒光分子，多次成像后，將這些分子的熒光圖像合成到一張圖上，得到了比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上的分辨率。PALM顯微鏡的分辨率僅僅受限于單分子成像的定位精度，理論上來說可以達(dá)到1nm的數(shù)量級。PALM的成像方法只能用來觀察外源表達(dá)的蛋白質(zhì)，而對于分辨細(xì)胞內(nèi)源蛋白質(zhì)的定位無能為力。

STROM與PALM的基本原理一致，區(qū)別在于STORM使用的熒光開關(guān)基團(tuán)是有機(jī)熒光分子對，而PALM使用的熒光開關(guān)基團(tuán)是熒光蛋白分子，由于STORM具有對細(xì)胞內(nèi)源性生物分子成像的優(yōu)勢，目前STORM在活細(xì)胞等生物體系的應(yīng)用更加廣泛。在空間分辨率上，STORM可以達(dá)到10-20nm，PALM可以達(dá)到20-30nm；在時間分辨率上，STORM可以達(dá)到1s，而PALM約為30s。

STORM與常規(guī)顯微成像方法對細(xì)胞內(nèi)微管成像效果對比
 

什么是多波長合束激光器？

合束激光器就是將多個波長光合束到一起輸出，它把合束/分束、透鏡、整形器件等全部集成并做了穩(wěn)固性的設(shè)計(jì)，各波長獨(dú)立控制?？梢宰尶蒲泄ぷ髡呋蚬こ處焸儗Ｐ挠谠囼?yàn)部分而不是做復(fù)雜的光路調(diào)節(jié)

傳統(tǒng)合束光路

OXXIUS合束激光器內(nèi)部光路設(shè)計(jì)

OXXIUS合束激光器都有啥干貨？

多8波長輸出~緊湊合理的尺寸~高穩(wěn)定輸出功率~高光束質(zhì)量~高速調(diào)制功能~強(qiáng)大智能性….
L4Cc是一款緊湊型多波長合束激光器（通用型激光引擎），它可將8個不同波長的激光耦合到一根單?；虮Ｆ饫w之中輸出，能同時或單獨(dú)對每一路激光進(jìn)行控制，單波長功率可達(dá)300mW。此外OXXIUS可根據(jù)客戶不同的要求進(jìn)行量身定制化的服務(wù)。同時我們具有遠(yuǎn)程診斷修復(fù)和自我保護(hù)功能，同時具有通過USB和RS232接口進(jìn)行軟件控制。激光器可進(jìn)行高速模擬調(diào)制或TTL調(diào)制。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
客戶可以自由選擇合束激光的數(shù)量（2個到 8個波長可選）
自由空間光輸出/各種光纖耦合輸出可選；
單光路或多光路輸出
智能性強(qiáng)（遠(yuǎn)程診斷修復(fù)和自我保護(hù)功能）；
軟件控制（通過USB和RS232接口）
高穩(wěn)定性，光束質(zhì)量高，噪聲低；
百M(fèi)HZ的TTL調(diào)制功能和模擬調(diào)制；
結(jié)構(gòu)緊湊，堅(jiān)固耐用；
可根據(jù)客戶的要求定制，不收取定制費(fèi)；
高性價比;

主要應(yīng)用：超分辨率成像、共聚焦顯微鏡、熒光激發(fā)、流式細(xì)胞儀、SPIM、FRAP、TIRF……
 

典型波長參數(shù)：

OXXIUS合束激光器家族部分解決方案：

（單光路輸出）                                      （雙光路輸出）

（8波長四光路輸出）                       （6波長可插拔光纖輸出）

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